Koç spermasının muhafazası, Sun’i tohumlamanın başlıca yararlarından birisi de, bir ejakulatla daha fazla sayıda koyun tohumlamaya olanak vermesidir. Böylece melezleme çalışmaları daha etkin ve yaygın sürdürülebilir. Bir ejakulattan daha fazla koyun tohumlamak spermanın hacminin ve yaşama süresinin artırılması ile olasıdır. Bunun için de spermanın sulandırılması gerekir. Sulandırılmış sperma, ya +5 0C de kısa süreli, yada -196 0C de uzun süreli muhafaza edilir.
Spermanın Kısa Süreli Muhafazası
Koç spermasının kısa süreli muhafazası için sulandırılması ve ısısının +5 0C ye düşürülmesi gerekir. Sperma sulandırıcısı olarak aşağıda bileşimleri verilen çok çeşitli solusyonlar kullanılmaktadır.
1) Sodyum sitrat – Glikoz – Yumurta sarısı Solusyonu:
Soduyum sitrat (Na3C6H5O7 2H20)………………. 2.37/gr.
Glikoz……………………… 0.80 gr.
Yumurta sarısı………………………………………… 20. 00 ml.
Damıtık su…………………………..100. 00 ml.
2) Tris Solusyonu:
Tris…………………………….. 0. 242gr.
Sitrik asit… 0. 134gr.
Fruktoz…………………………….. 0. 100gr.
Yumurta sarısı…………………………………………. 2. 000 ml.
Damrtık su………………………… 8. 000 ml.
3) Glikoz – Fosfat Solusyonu:
Sodyum fosfat……………………………………… 1. 540gr.
Potasyum fosfat……………………… 0.320 gr.
Glikoz……………. 0. 620 gr.
Yumurta sarısı……………………… 2. 000 ml.
Distile su………………………… 8. 000 ml.
4) Süt Solusyonu:
Süt tozu………… 1. 000 gr.
Yumurta Sarısı………… 2. 000 ml.
Bi distile su…………… 8. 000 ml.
Sulandırıcılar ya taze olarak hazırlanmalı ya da önceden hazırlanmışsa kullanılıncaya kadar buzdolabında saklanmalıdır. Gerek spermadaki ve gerekse tohumlamadan sonra koyunun genital kanalındaki saprofit ve patojen mikroorganizmaların öldürülmesi ve bu suretle dölveriminin artırılması amacıyla, sulandırıcıya beher 1 cm3 için 500 i.ü. penisilin, 0.5 mgr. streptomycin katılmalıdır.
Bu klasik yolun dışında, en iyisi spermadan antibiyogram yapılarak mevcut mikroplara en uygun antibiyotiklerin kullanılmasıdır. Son zamanlarda, sperma sulandırıcılarına çoğunlukla geniş spektrumlu antibiyotikler katılmaktadır.
Spermanın Sulandırılmasında 3 Kural
Spermanın sulandırılmasında 3 kurala mutlaka uymak gerekir
1) Daima sulandırıcı spermaya katılmalıdır.
2) Sulandırıcının ve spermanın ısısı aynı olmalıdır.
3) Gerek sulandırıcıların hazırlanması, gerekse sulandırma sırasında asepsi antisepsi kurallarına mutlaka uyulmalı, özellikle kullanılan tüm cam malzeminin temiz ve steril olmasına özen gösterilmelidir.
Sulandırma oranı hazırlanacak tohumlama dozuna göre ayarlanır. Koyun sun’i tohumlamasında kural, bir tohumlama dozunda, yani 1 cm3 sulandırılmış spermada, 100 milyon adet motil spermatozoon bulunmasıdır. Buna göre tohumlama dozu ve sulandırma oranı şu şekilde hesaplanır:
Elimizde spermatozoon yoğunluğu 3 milyar, motilitesi %80 olan 1 cm3 sperma mevcut olduğunu varsayalım. O halde, 3 milyar toplam spermatozoon’a, 2.4 milyar da motil spermatozoa’ya sahibiz demektir. Bir tohumlama dozunda 100 milyon motil spermatozoon bulunacağına göre, elimizde mevcut 2.4 milyar motil spermatozoonla 24 doz hazırlayabiliriz. Bir tohumlama dozu 1 cm3 sulandırılmış sperma olduğuna göre, elimizde 24 cm sulandırılmış sperma bulunması gerekir. Koçtan elde ettiğimiz sperma 1 cm3 olduğuna göre, buna 23 cm3 sulandırıcı ilave etmekle, beher cm3 ünde 100 milyon motil spermatozoon bulunan sulandırılmış sperma elde etmiş oluruz.
Sperma sulandırılıp hacmi artırıldıktan sonra aynı ısıda uzun süre bulundurulursa spermatozoonlar süratle canlılıklarını yitirirler. Spermanın canlılığını yitirmeden kısa süre koç spermasının muhafazası istendiğinde, hareketlerinin kısıtlanıp, enerji tüketimlerinin azaltılması gerekir. Böylece, spermatozoon’lar seminal plazma ve sulandırıcıda bulunan besin maddelerinden daha uzun süre yararlanma olanağını bulacaklar ve daha uzun süre yaşayacaklardır. Bu amaçla, sulandırılmış spermanın ısısı +5 0C ye düşürülerek hareketleri kısıtlanır ve daha az enerji tüketmeleri sağlanır.
İçinde sulandırılmış sperma bulunan derceli cam silindir 30-35 0C lik ılık su bulunan bir kaba konulup, suyun içine buz parçaları atılmak suretiyle spermanın ısısı önce 15-18 0C ye, daha sonra buzdolabında +5 0C ye düşürülür. Burada dikkat edilecek önemli bir nokta, buz parçalarının spermaların içinde bulunduğu cam silindir yüzeyine değmemesine özen gösterilmesidir.
Isısı +5 0C ye düşürülen sulandırılmış sperma 10 cm3 lük cam tüplere bölünerek tohumlamada kullanılıncaya kadar buzdolabında saklanır. Eğer sperma uzak bir yere gönderilecekse, tüpler +5 0C ısıda su bulunan termoslar içine konularak taşınmalıdır.
Bu şekilde hazırlanan sperma asgari 3 gün süreyle motilitesini ve canlılığını yitirmeden saklanabilir.
Uzun Süreli Koç Spermasının Muhafazası
Koç spermasının uzun süreli muhafazası ancak dondurulması ile mümkündür. Ne var ki, koç spermasının dondurularak tohumlamada kullanılması konusundaki çalışmalarda istenilen düzeyde ne Türkiye’de, ne de Dünya’da henüz başarılı döl verimi sonuçları alınabilmiş değildir. Bunun çok çeşitli nedenleri bulunmaktadır.
Dondurulmuş koç spermatozoonları üzerinde yapılan elekronmikroskobik çalışmalardan, dondurma sırasında özellikle spermatozooon’ların akrozomlarında çeşitli derecelerde defektlerin oluştuğu, çoğu kez spermatozoon membranının parçalanarak akrozom içeriğin tümüyle dışarı çıktığı gözlenmiştir. Akrozom, fertilizasyon için gerekli enzimleri oluşturan bir hücresel organeldir. Akrozom parçalandığında enzimler dışarı çıkmakta, dolayısıyla fertilizasyon ve gebelik oluşmamaktadır.
Bu sorunun çözümüne yönelik araştırmaların son aşamasında, spermatozoon membran dayanaklığını artırıcı ve A vitamini‘nin oksitlenmesini önleyici antioksidanların, özellikle Vitamin E nin gerek spermaya ve gerekse koç rasyonlarına katılması suretiyle oldukça başarılı döl verimi sonuçlarının alındığı bildirilmektedir. Ne var ki, sorun yine de tümüyle çözümlenmiş değildir.
Koç sperması başılıca iki yöntemle dondurulmaktadır. Bunlardan biri “payet” diğeri de “pelet” yöntemidir. Pelet yöntemi üzerinde, uygulamada kullanım olanağı bulunmadığı için durulmayacak, sadece payet yönteminden söz edilecektir.
Spermanın Payet Yöntemi ile Dondurulması
Bu yöntem ilk kez Fransızlar tarafından uygulanmış olup, “Cassou Yöntemi” olarak da anılmaktadır. Payet yönteminin esası, sulandırılıp çeşitli işlemlerden geçirilmiş olan spermanın “Payet” adı verilen PVC (polivinil klorür) borucuklar içinde sıvı azot buharında dondurulup – 196 0C de sıvı azot içinde muhafazasıdır.
Spermanın Payet yöntemiyle dondurulmasının aşamaları şunlardır;
İlk Sulandırma Evresi
Koçtan alınan, gerekli spermatolojik muayeneleri yapıldıktan sonra tohumlamada kullanılmasına karar verilen sperma, önce sulandırıcının gliserolsüz bölümü ile sulandırılır. Bunun için, “Spermanın Kısa Süreli Muhafazası” bölümünde bileşimleri verilen sulandırıcılardan herhangi birisi kullanılabilir.
Ne varki, öncelikle doz ayarlaması bakımından sperma sulandırma oranının saptanması gereklidir. Bu konuda şu örneği verebiliriz:
Örneğin elimizde 1 cm3 hacminde, motilitesi % 80, sperma yoğunluğu 3 milyar olan bir sperma numunesi olduğunu varsayalım. 0.5 cm3 lük payetlerde 100 milyon adet motil spermatozoon bulunacak biçimde dozlanacak spermanın sulandırma oranı şu şekilde hesaplanır. Sperma 3 milyar toplam, 2.4 milyar da motil spermatozoon içermektedir. Tohumlama dozu ya da payette bulunması gereken spermatozon sayısı, 100 milyon olması gerektiğine göre, elimizde mevcut 2.4 milyar motil spermatozoon’dan 24 doz hazırlayabiliriz demektir. Bir tohumlama dozu 0.5 cm3 sulandırılmış sperma olduğuna göre, elimizde 12 cm3 sulandırılmış sperma bulunması gerekir. Sperma dondudurulma sırasında iki aşamada sulandırıldığından, ilk sulandırma evresinde 1 cm3 sperma üzerine 5 cm3 sulandırıcı azar azar ve sperma bulunan kap sürekli sallanarak katılır.
Sperma ısısının +5 0C ye Düşürülme Evresi
İlk sulandırılması yapılan sperma, sulandırıldığı kap içerisinde, 25-30 0C ısıda su içeren bir kaba konularak deep – freez’e bırakılır ve ısının 30-45 dakika içinde kendiliğinden 5 0C ye düşmesi beklenir. Isının daha çabuk düşmesi istendiğinde kaptaki suya sperma kabına değmeyecek biçimde buz parçaları atılarak ısı önce 25-30 0C den 15-18 0C ye, ardından da deep -freez’e konularak kendiliğinden +5 0C ye düşürülür.
Gliserolleme (Gliserolizasyon)
Isısı +5 0C ye düşen ve ilk sulandırması yapılmış olan sperma, bu kez aynı ısı derecesindeki sulandırıcının gliserol içeren bölümü ile 30 dakika içinde 5-6 porsiyon halinde karıştırılır. İlk sulandırma evresinde belirtilen hesaplamaya göre gliserolizasyonda, ilk sulandırması yapılmış ve ısısı 4-5 0C ye düşürülmüş 6 cm3 sperma üzerine, 0.84 cm3 gliserol ve 5.16 cm3 sulandırıcı içeren gliserollü bölüm katılır. Böylece, içinde % 7 gliserol içeren, toplam 12 cm3 sulandırılmış sperma elde edilmiş olur.
Spermaya gliserol katılmasının nedeni, giiserolün higroskobik (su çekici) özelliğinden yararlanarak, ortamdaki suyu çekmek, spermanın büyük değil, çok küçük kristaller halinde, yani camlaşma biçiminde (vitrifikasyon) donması sağlanarak, spermatozoon’ların büyük kristaller arasında sıkışıp parçalanmalarını önlemektir. Gliserolizasyon işleminden sonra sperma otomatik doldurma ve kapatma makinası ile payetlere doldurulur.
Alışım (Ekilibrasyon) Evresi
Payetlere çekilen sperma soğutucu kabın içersinde plastik kaplarda bulunan +5 0C deki su içeresine atılarak en az iki saat süreyle bırakılır. Bu işleme Ekilibrasyon adı verilir ve spermanın gliserole alışması için gerekli olan bir işlemdir.
Dondurma (Freezing) Evresi
Ekilibrasyon işlemi sonunda sudan alınan payetler kurulandıktan sonra raflara dizilir ve dondurulmak üzere büyük dondurma kazanlarına götürülür. Dondurma kazanları içerisinde bulunan delikli tabla ile sıvı azot yüzeyi arasında yaklaşık 5 cm aralık bulunması gerekir. Bu şekilde önceden hazırlanan kazan yarım saat kadar kapalı bırakılarak gereken yoğunlukta buhar oluşmasına olanak sağlanır. Raflara dizilen payetler kazanın kapağı açılmak suretiyle 7 dakika süreyle, donacakları delikli tablaların Üzerine konur ve böylece sperma dondurulmuş olur. Dondurulan payetler plastik kaplara (Goblet) konularak dondurma kazanındaki sıvı azot dolu metal kaplara (Karister) yerleştirilir ve kullanılıncaya kadar orada koç spermasının muhafazası edilir.
Çözündürme (Thawing) Evresi
Donmuş spermanın kullanılacağı zaman çözülmesi gerekir. Tohumlamada kullanılmak üzere teknisyen termoslarına nakledilen payetler kullanılacağı zaman 34 0C lik ılık suda 15 saniye bırakılmak suretiyle çözülür ve daha sonra tohumlamada kullanılır.
Kaynakça
