Koyunlarda embrio nakli, fertilize olmuş ve normal gelişmesine devam eden zigot’un (zigotların) ana hayvanın oviduct ya da uterusundan alınarak hemen veya dondurularak kısa – uzun süre saklandıktan sonra aynı türde diğer bir hayvana nakli ve gebelik – doğum sürecini burada tamamlaması olarak tanımlanabilir.
Koyunlarda embrio nakli, saf ve üstün verimli genotipin en kısa zamanda yaygınlaştırılması için uygun bir yöntem olarak gösterilmektedir. Koyunların bireysel maddi değerlerinin fazla olmaması nedeniyle ineklerde olduğu kadar sık başvurulmamasına rağmen koyunlarda embrio nakli, uluslararası hayvan alışverişinin yasal olarak yasak veya sakıncalı olduğu durumlarda yeni ırk ve kan guruplarının kolay ve ucuz olarak ulaşımı amacıyla uygulama sahası bulabilmektedir.
Koyunlarda embrio nakli yöntemi, verici ve taşıyıcı anaların seçimi, verici ve taşıyıcıların seksüel senkronizasyonu, vericinin süperovulasyonu, vericinin tohumlanması, embrio (embrioların) elde edilmesi, embrioların işlevsel ve morfolojik özelliklerinin incelenmesi, embrionun kısa veya uzun süre saklanması, embrio nakli aşamalarından oluşmaktadır.
Verici ve Taşıyıcı Anaların Seçimi
Verici koyunların üstün genotipik ve fenotipik özellikleri yanısıra, fertilitesi yüksek hayvanlar arasından seçilmesi önemlidir. Taşıyıcıların da verimleri düşük olabilmekle birlikte fenotip olarak vericilere yakın, iyi gelişmiş, normal besili ve fertilitesi normal koyunlar olmaları gereklidir.
Embrio naklinde kullanılacak verici ve taşıyıcı anaların seksüel sikluslarının sağlıklı ve devamlı olması göz önünde tutulması gereken önemli bir husustur. Bu nedenle, koyunların embrio nakli genellikle aşım sezonunda, koyunların seksüel aktiviteleri izlendikten sonra uygulanmaktadır. Normal koşullarda her verici için 10 taneye kadar taşıyıcı koyun ayrılabilir.
Seksüel Siklusların Senkronizasyonu
Özellikle belirli ve az sayıda materyal ile çalışılıyorsa seksüel senkronizasyon gereklidir. Elde fazla sayıda, taşıyıcı olabilecek koyun varsa, doğal östrüs gösterenler taşıyıcı koç ile gündelik olarak belirlenip verici ile doğal senkronize koyunlar nakil için kullanılabilirler.
Verici ve taşıyıcıların senkronizasyonu progestagenler ya da prostaglandin F2alfa veya analogları ile sağlanabilir. Prostagenler en etkili olarak vaginal sünger formunda kullanılarak, istenen östrüsten 2-3 öncesine kadar (11-14 gün) vagina da tutulabilirler. Verici koyunlarda süperfollikülasyonu uyarmak için Gonadotropinler kullanıldığından, taşıyıcıların progestagen süngerleri vericilerden bir gün erken çıkartılabilir. Bu arada taşıyıcılara süngerlerin çıkartıldığı günlerde düşük dozlarda (300-500 uı) PMSG hormonu enjekte edilerek ovulasyon garanti altına alınabilir.
Prostaglandinler ise verici ve taşıyıcılara 7-9 gün ara ile iki defa enjekte edilerek senkronizasyon sağlanabilir.
Koyunlarda Embrio Nakli İçin Vericinin Süperovulasyonu
Senkronize edilmemiş vericilerde Gonadotropik hormonlar, luteal fazın sonuna doğru (12 gün), corpus luteum henüz lize olmadan önce enjekte edilerek süperovulasyon şekillendirilebilir. Bu amaçla, PMSG, FSH, EPE veya HAP hormonları kullanılabilir. PMSG hormonu 40-50 Kg lık bir koyuna 1200 – 1300 uı, daha iri koyunlara ise 1500 – 1700 uı dozlarda verilebilir.
Seksüel siklusları senkronize edilmiş vericilerde ise, gonadotropinler, progesteron uygulamasının bitiminden ya da ikinci prostaglandin enjeksiyonundan 24 saat önce enjekte edilir.
FSH ve HAP uygulamalarında, bu hormonların yarılanma ömürlerinin kısa olması nedeniyle son progestagen veya prostaglandin uygulamasından bir gün önce başlanarak, 12 saat ara ile 3 gün bölünmüş dozlarda enjekte edilmeleri gerekir.
Vericinin Tohumlanması
Verici koyunlara doğal aşım ya da sun’i tohumlama yapılabilirse de, yüksek bir fertilizasyon sağlamak için spermanın doğrudan cornu uteri’lere enjeksiyonu tercih edilmektedir.
Progestagen süngerlerinin çıkartılmasından 48 saat sonra veya östrus gösterdiği arayıcı koç ile belirlenen verici koyunlara, lokal infiltrasyon anestezisi altında median çizgiden laparatomi yapılarak uterus özenle dışarı alınır. Uterotubal noktanın 4-5 cm gerisinden her iki cornu uteri’ye doğrudan 0.01 – 0.02 mi sperma enjekte edilir. Operatif tohumlama ile % 90 ın üstünde fertilizasyon sağlandığı bildirilmektedir.
Embrioların Elde Edilmesi
Koyun embrioları fekondasyondan sonraki oviduct içindeki yolculuklarını ortalama üç günde tamamlayarak uterusa ulaşırlar. Erken dönemdeki embriolar manuplasyonlara fazla dayanıklı olmadıklarından embrio toplama işlemi 3-7 günlerde yapılabilir.
Embrioların toplanması işlemi, uterusa özel bir vasatın enjekte edilmesinden sonra, oviduct’un serbest ucuna uygulanan bir kanül aracılığıyla verilen sıvının toplanması şeklinde yapılır. Koyunlarda uterusu yıkamak için genel anestezi ya da kuvvetli bir sedasyon ve lokal anestezi altında, median çizgiden yapılan bir ensizyonla uterus dışarı alınır. Oviduct’un serbest ucu bulunarak buraya eğri bir cam kanül yerleştirilir. Daha sonra küt bir iğne ile uterus duvarı delinerek, bir enjektör yardımıyla 10 ml kadar vasat özenle uterus lumenine enjekte edilir. Vasatın geriye doğru akmaması için bifurkasyon noktasına bir barsak pensi uygulanabilir. Daha sonra uterus duvarına, içeriği cornu uteri’lerin ucuna doğru yönlendiren özenli masajlar yapılarak, uterus yıkantısı Oviduct’tan geçirilip kanül aracılığı ile petri kutularına toplanır. Aynı işlemler diğer cornu uteri’de de yinelenir. Uterusun yıkanma işlemi bittikten sonra lumenine bir miktar antibiyotik verilmesi yararlı olur. Daha sonra uterus yerine yerleştirilerek karın duvarı kapatılır.
Uterusu yıkamak için kullanılacak vasatın pH’sının 7.2-7.8 arasında ve osmolitesinin 300 mOsm olması gerekmektedir. Bu amaçla, 3 mg/ml sığır serum albumini ile zenginleştirilmiş Dulbecco’nun modifiye Fosfat Buffer Vasatı (PBS) oldukça sık kullanılmaktadır.
Embrioların Değerlendirilmesi
Steril petri kutularında toplanan uterus yıkantısı, stereomikroskopta, X12-50 büyütmelerle incelenebilir. Mikroskop altında belirlenen embriolar teker teker, ucuna tüberkülin şırıngası iliştirilmiş pastör pipetleri ile alınarak, saat camı şeklinde kapta toplanırlar. Yıkantıdaki embrioların tamamının toplanmasından sonra değerlendirilmeleri yapılır.
Değerlendirme morfolojik olarak yapılmaktadır. Çalışmalar, süperovulasyon için uyarılan koyunlarda embrioların % 20-30 oranında dejenere veya döllenmemiş olabileceğini ortaya koyulmuştur. Koyun embrioları 4. günde 8-20 blastomerli, 5. ünde ise erken morula aşamasındadır.
İdeal bir embrio dolgun ve küre şeklindedir. Blastomerleri eş büyüklükte ve renktedir. Rengi ne açık ne de çok koyudur. Sitoplazmada granulasyon olmayıp, orta büyüklükte vakuoller yer alabilir. Perivitellin aralığı boş olup, Zona pellucida’sı buruşuk veya kollabe değildir. Bu ölçüler göz önünde tutularak embrioların yaşam şansları ve nakledilebildikleri hakkında karar verilir.
Koyunlarda Embrio Nakli Nasıl Yapılır?
Koyunlarda nakiller vaginal yolla yapılabilmekle birlikte, halen en iyi sonuçlar operatif yöntemle yapılan nakillenden alınmaktadır.
Lokal veya daha iyisi genel anestezi altındaki taşıyıcılarda median çizgiden yapılan ensizyon ile uterus dışarı alınır. Pastör pipetine 0.01 ml vasat ile birlikte çekilen embrio, Corpus luteum’un yer aldığı ovaryum tarafındaki Cornu uteri’nin uç kısmına, önceden küt bir iğne ile yapılan punksiyon deliğinden geçirilerek enjekte edilir. Daha sonra uterus özenle yerine yerleştirilir ve karın duvarı kapatılır.
Nakil yapılan taşıyıcılara Ritodrin hidroklorür (25 mg i.m.) enjekte edilerek uterusta relaksasyon sağlamak yararlı olabilir.